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Tipo do documento: Tese
Título: Transformação genética de Urochloa brizantha para tolerância ao déficit hídrico e validação de genes normalizadores para estresses abióticos
Título(s) alternativo(s): Genetic transformation of Urochloa brizantha for tolerance to water deficit and validation of normalizing genes for abiotic stresses
Autor: Takamori, Luciana Midori 
Primeiro orientador: Ribas, Alessandra Ferreira
Primeiro membro da banca: Vendruscolo, Eliane Cristina Gruszka
Segundo membro da banca: Pereira, Luiz Filipe Protasio
Terceiro membro da banca: Machado Neto, Nelson Barbosa
Quarto membro da banca: Santos, Tiago Benedito dos
Resumo: O capim braquiária é originário da África e pertence ao gênero Urochloa. Extensas áreas de pastagens são cultivadas com poucos cultivares devido a dificuldade no melhoramento genético dessa espécie. A espécie U. brizantha é tetraploide e apomítica e a mais cultivada no Brasil sendo utilizada tanto para alimentação animal quanto para a cobertura vegetal. A transformação genética é uma ferramenta importante para a introdução de genes com características de interesse agronômico. Ainda não existem cultivares transgênicos para as espécies do gênero Urochloa. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo para obtenção de plantas geneticamente modificadas de Urochloa por biobalística. Foram testados três tipos de explantes de Urochloa: epicótilo, calos de epicótilo e calos derivados de sementes pré inoculadas por cinco dias em meio MS contendo auxina 2,4-D ou picloram (1 mg L-1), as distâncias de 3, 6, 9 e 12 cm do microcarreador ao explante, e as concentrações de 30 e 60 mg.ml-1 de partículas. O vetor pANIC 6E e a pressão de 1100 psi foram utilizadas para avaliar a expressão transiente do gene uidA. A maior expressão do gene uidA foi observada quando calos induzidos a partir de sementes foram bombardeados na distância de seis cm e na concentração de 60 mg.ml-1 de partículas do ouro. Após a determinação dos melhores parâmetros, calos derivados de sementes foram bombardeados com o vetor pJS107 o qual contém o gene p5cs (Δ1 - pirrolina - 5 - carboxilato sintetase) e o gene bar. Calos bombardeados foram cultivados em meio seletivo contendo 2 mg L-1 de glufosinato de amônio. Foram regeneradas um total de 91 plântulas in vitro. As plantas foram aclimatizadas em casa-de-vegetação e submetidas a análise pela PCR para os genes inseridos. Um total de 79 plantas foram analisadas. Os fragmentos correspondentes aos gene bar (450 pb) e ao gene p5cs (580 pb) foram amplificados em 21 e 13 plantas, respectivamente. Somente 8 plantas apresentam os fragmentos correspondentes aos dois genes. A eficiência de transformação foi de 0,32%. Eventos transgênicos e planta controle (não transformada) foram submetidas ao déficit hídrico (-2,9 a -3,4 MPa) e a concentração de prolina nas folhas foi determinada. Os eventos transgênicos apresentaram até 1,9 vezes mais prolina que a planta controle em condições de estresse hídrico. O capítulo 2 dessa tese refere-se á validação dos genes normalizadores para estresses abióticos (frio, calor e seca) em U. Brizantha. Foi avaliada a estabilidade de nove genes de referência: Actina 12, fator de iniciação eucariótica 4A, fator de alongação-1 alfa, FTSH protease 4, fator auxiliar U2, succinol co-enzima A, tubulina alfa-5, tubulina beta-6, ubiquitina enzima conjugada. A expressão dos genes de refer^ncia foi medida por RTqPCR em amostra de folhas submetidas a 6, 12 e 24 h de frio e calor (10 e 45°C respectivamente) e ao déficit hídrico moderado (-0,5 a -0,7 Mpa), severo (-1,1 a -1,8 Mpa) e recuperadas após a irrigação. O programa RefFinder foi utilizado para classificar os genes de referência mais estáveis em cada estresse. O fator de alongação-1 alfa, a ubiquitina enzima conjugada ou fator de alongação-1 alfa e o fator de iniciação eucariótica 4A foram os genes mais estáveis para os estresses de calor, frio e seca, respectivamente. A expressão do gene da Rubisco foi normalizada contra o gene mais estável selecionado pelo RefFinder para cada estresse para validação.
Abstract: Brachiaria grass comes from Africa and belongs to the genus Urochloa. The U. brizantha is tetraploid and apomictic and is the species more cultivated in Brazil, being used for both animal feeding and vegetation cover. Extensive pasture areas are cultivated with few cultivars due to a lack of genetic improvement of this species. Genetic transformation is an important tool for introducing genes with desirable agronomic traits. However, there are still no transgenic cultivars for the species of the genus Urochloa. The aim of this work was to develop a protocol to engineer genetically modified Urochloa plants by biobalistic delivery system. Three types of explants were tested: epicotyl, calli from epicotyl and seed pre-inoculated for 5 days in MS medium containing 2,4-D auxin or picloram (1 mg L-1). The distances of 3, 6, 9 and 12 cm from the microcarrier to the explant, and the particle concentration 30 or 60 mg.ml-1. The pANIC6E vector and the pressure of 1100 psi were used to evaluate the transient expression of the uidA gene. The highest expression of the uidA gene was observed when calluses induced from seeds were bombarded at the distance of six cm and at the concentration of 60 mg.ml-1 of gold particles. After determining the best parameters, calli derived from seeds were bombarded with the pJS107 vector which contains the p5cs (Δ1 - pyrroline - 5 - carboxylate synthetase) and the bar genes. Bombarded calli were cultured in a selective medium containing 2 mg L-1 of ammonium glufosinate. A total of 91 seedlings were regenerated in vitro. The plantlets were acclimatized in greenhouse and submitted to PCR analysis. A total of 79 plants were analyzed. Fragments corresponding to the bar (450 bp) and the p5cs (580 bp) genes were amplified in 21 and 13 plants, respectively. Only 8 plants present the fragments corresponding to the two genes. The transformation efficiency was 0.32%. Transgenic events and control plants (untransformed) were submitted to water deficit (-2.9 to -3.4 MPa) and the proline concentration in the leaves was determined. The transgenic events presented up to 1.9 times more proline than the control plant in conditions of water stress. Chapter 2 of this thesis refers to the validation of the normalizing genes for abiotic stresses (cold, heat and dry) in U. brizantha. The stability of nine reference genes: Actin 12, eukaryotic initiation factor 4A, alpha elongation factor-1, FTSH protease 4, U2 helper factor, succinol coenzyme A, tubulin alpha-5, tubulin beta-6, ubiquitin conjugated enzyme. Expression of the reference genes was measured by RTqPCR in leaf samples submitted to 6, 12 and 24 h of cold and heat (10 and 45 ° C respectively) and to moderate water deficit (-0.5 to -0, 7 Mpa), severe (-1.1 to -1.8 MPa) and recovered after irrigation. The RefFinder program was used to classify the most stable reference genes in each stress. The elongation factor-1 alpha, the ubiquitin conjugated enzyme or elongation factor-1 alpha, and the eukaryotic initiation factor 4A were the most stable genes for the heat stresses, cold and dry, respectively. The expression of the Rubisco gene was normalized against the most stable gene selected by RefFinder for each stress for validation.
Palavras-chave: Urochloa. Transgênico. Transiente. Estresse Abiótico. Prolina.
Urochloa. Transgenic. Transient. Abiotic Stress. Proline.
Área(s) do CNPq: CIENCIAS AGRARIAS::AGRONOMIA
Idioma: por
País: Brasil
Instituição: Universidade do Oeste Paulista
Sigla da instituição: UNOESTE
Departamento: Doutorado em Agronomia
Programa: Doutorado em Agronomia
Citação: Takamori, Luciana Midori. Transformação genética de Urochloa brizantha para tolerância ao déficit hídrico e validação de genes normalizadores para estresses abióticos. 2018. 122f. Tese (Doutorado em Agronomia) - Universidade do Oeste Paulista, 2018.
Tipo de acesso: Acesso Aberto
URI: http://bdtd.unoeste.br:8080/jspui/handle/jspui/1135
Data de defesa: 3-Dec-2018
Appears in Collections:Doutorado em Agronomia

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